Preparação de grandes amostras biológicas para alta

Nature Protocols volume 18, páginas 1441–1461 (2023)Cite este artigo

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A obtenção de imagens em diferentes escalas é essencial para entender a morfologia de órgãos saudáveis ​​e as alterações fisiopatológicas. A morfologia tridimensional macro e microescala de grandes amostras, incluindo órgãos humanos intactos, é possível com microtomografia de raios-X (usando fontes de laboratório ou síncrotron). A preparação de grandes amostras para imagens de alta resolução, no entanto, é desafiadora devido a limitações como encolhimento da amostra, contraste insuficiente, movimento da amostra e formação de bolhas durante a montagem ou digitalização. Aqui, descrevemos a preparação, estabilização, desidratação e montagem de grandes amostras de tecidos moles para microtomografia de raios-X. Detalhamos o protocolo aplicado a órgãos humanos inteiros e tomografia hierárquica de contraste de fase no European Synchrotron Radiation Facility, mas é aplicável a uma variedade de amostras biológicas, incluindo organismos completos. O protocolo aumenta o contraste ao usar imagens de raios X, enquanto evita o movimento da amostra durante a varredura, mesmo com diferentes orientações de amostra. As bolhas presas durante a montagem e aquelas formadas durante a varredura (no caso de imagens de raios-X síncrotron) são mitigadas por várias etapas de desgaseificação. A preparação da amostra também é compatível com ressonância magnética, tomografia computadorizada e observação histológica. A preparação e montagem da amostra requerem 24–36 d para um órgão grande, como um cérebro ou coração humano inteiro. O tempo de preparo varia de acordo com a composição, tamanho e fragilidade do tecido. O uso do protocolo permite a varredura de órgãos intactos com um diâmetro de 150 mm com um tamanho de voxel local de 1 μm. O protocolo requer usuários com experiência no manuseio de órgãos humanos ou animais, operação de laboratório e imagens de raios-X.

A quantificação da morfologia dos órgãos humanos, tanto na saúde como na doença, é uma tarefa complexa que pode ser abordada por modalidades de imagem espacial multimodais, capazes de abranger escalas dimensionais. A caracterização morfológica completa do tecido requer a detecção de interações entre as escalas; no entanto, a maioria das técnicas de imagem é limitada pela resolução ou pelo campo de visão, tornando difícil fazer a ponte entre observações e dados macroscópicos e microscópicos. As abordagens convencionais de histologia1,2,3 ou microscopia eletrônica4,5,6 permitem a visualização da organização e composição microestrutural do tecido por meio de cortes seriados, e os dados podem ser adequadamente quantificados; no entanto, essas abordagens normalmente requerem amostragem e seccionamento do tecido e são extremamente trabalhosas e demoradas. Clareamento óptico combinado com microscopia de folha de luz pode fornecer um grande campo de visão com alta resolução; no entanto, a limpeza de tecidos também requer grandes escalas de tempo e geralmente é cara; além disso, a profundidade da imagem para um microscópio de folha de luz é limitada pela distância de trabalho da lente objetiva7,8. Mesmo quando órgãos inteiros de humanos adultos8 ou animais inteiros9 foram removidos por um período de vários meses, sua imagem continua sendo um desafio. Desvantagens semelhantes se aplicam à tomografia de coerência óptica10,11, microscopia multifotônica12 ou microscopia confocal13,14, que podem capturar a microestrutura tridimensional (3D) local do tecido na escala celular, mas têm penetração tecidual limitada, dificultando a imagem de tecidos profundos15. Recentemente, imagens de ressonância magnética (MRI) de alta resolução alcançaram um tamanho de voxel isotrópico de 100 µm em todo o cérebro humano ex vivo16. Embora a RM seja não destrutiva e tenha um grande campo de visão17, a resolução ainda não é suficiente para examinar a microestrutura do tecido. Técnicas de imagem hierárquicas são capazes de superar o trade-off entre resolução e campo de visão. Em uma abordagem hierárquica, várias imagens da mesma amostra são adquiridas em diferentes resoluções para unir as diferentes escalas. A tomografia microcomputadorizada (µCT) tem sido usada para obter imagens de pulmões inteiros com uma resolução de voxels de 150 μm, seguida pela extração subsequente de núcleos de biópsia nos pulmões; esses pequenos núcleos foram então escaneados com µCT para atingir voxels de 10 μm18.